一、實驗目的
1. 建立Kibron儀器檢測益生菌發酵液動態表面張力、計算AUC張力面積的標準化可復現操作流程，整合界面吸附速率、吸附總量、平衡張力多維度信息，彌補單一平衡張力參數的局限性。
2. 精準獲取不同益生菌菌株、不同發酵周期發酵上清的AUC張力面積參數，量化菌株代謝界面活性物質的綜合能力。
3. 同步開展益生菌體外益生潛力檢測，構建AUC張力面積與菌株黏附、抑菌、乳化等益生功能的關聯體系。
4. 建立理化界面參數結合功能指標的益生菌篩選、發酵工藝優化評價體系。
二、儀器材料與試劑準備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀，可選EZ?Pi Plus單通道、Delta?8高通量機型，配套DyneProbe鉑銥探針、溫控樣品臺及專用分析軟件。配備高速冷凍離心機、真空脫氣裝置、精密pH計、超純水機、恒溫搖床，數據處理設備用于梯形法AUC積分計算。單通道適配3640型號PTFE樣品杯，高通量適配DynePlate 96孔微孔板。
2. 試劑與樣品
待測益生菌菌株，包含乳桿菌、雙歧桿菌等常用功能菌株，配套專用液體發酵培養基。設置未接種、同步孵育的空白培養基對照組。配備益生菌體外益生潛力檢測所需試劑，病原菌菌株、細胞培養體系、乳化測試用油相等。所有培養基提前真空脫氣10至15分鐘，去除溶解氣泡干擾。
3. 耗材
無菌低吸附離心管、無水乙醇、0.22μm低吸附水系濾膜、無菌低吸附移液槍頭。濾膜需提前用對應發酵培養基潤洗，避免吸附益生菌胞外多糖、脂肽等活性物質，減少實驗誤差。
4. 儀器校驗準備
將儀器放置在無震動、無空調直吹的平穩臺面，整機通電預熱60分鐘，全程關閉防風罩。鉑銥探針依次用超純水沖洗、無水乙醇沖洗、高純氮氣吹干，檢查探針尖端無彎折、無殘留污漬。在25℃恒溫條件下完成純水張力校準，純水表面張力穩定在72.0至72.8mN/m，儀器通道偏差小于0.2mN/m，基線無漂移即為校驗合格。統一設定實驗測試溫度為25.0±0.5℃。
三、益生菌發酵液樣品制備
1. 菌株培養取樣
將保存的益生菌菌株常規活化處理，轉接至液體發酵培養基，設置標準搖床發酵條件，每組菌株設置3組生物學平行樣本。同時設置未接種的空白培養基，與實驗組在相同條件下同步孵育。按照實驗梯度，分別在0h、12h、24h、36h、48h進行定點取樣。
2. 樣品預處理
采集的菌液置于高速冷凍離心機，8000g離心20分鐘，徹底去除菌體細胞與沉淀雜質，緩慢吸取上層澄清上清液。使用提前潤洗好的0.22μm低吸附濾膜對上清液過濾，去除微小殘留顆粒。全程操作輕柔，禁止劇烈渦旋震蕩，防止產生氣泡或破壞活性物質結構。
3. 樣品分組與保存
實驗樣品分為各組益生菌發酵上清液、同批次空白培養基對照組。單通道測試樣品體積控制在150至200μL，高通量96孔板每孔加樣50μL。樣品遵循現提現測原則，益生菌代謝活性物質穩定性較弱，若需短期存放，4℃避光保存不超過12小時，上機前恢復至室溫。
4. 樣品平衡處理
過濾完成的待測樣品與空白樣品，室溫靜置平衡30分鐘，使液面狀態、溶液組分完全穩定。目視檢查樣品無沉淀、無氣泡，存在氣泡的樣品需重新制備。
四、Kibron上機完整操作流程
1. 軟件參數設置
新建動態表面張力時間掃描測試方案，恒定測試溫度25℃。根據益生菌界面吸附特性，設置總采集時長90至120分鐘，完整覆蓋吸附全過程，保證曲線達到平衡平臺，滿足AUC積分計算要求。數據采集間隔2至5秒每點，探針下降速度2mm/min，探針液面浸入深度固定0.3mm，每個樣品設置2次技術重復。
2. 上樣操作
單通道測試取150至200μL發酵上清液，沿PTFE樣品杯杯壁緩慢加樣，避免沖擊液面產生氣泡。將樣品杯固定在溫控樣品臺，關閉防風罩靜置8至10分鐘，消除移液擾動。待液面完全穩定后，控制探針下降接觸氣液界面，啟動數據采集，全程記錄動態張力變化曲線。
高通量96孔板測試，每孔緩慢加入50μL樣品，避免觸碰孔壁與液面。加樣完成后逐孔檢查，剔除含氣泡微孔，將微孔板固定卡槽，將待測樣品與空白樣品均勻排布在同一板內，統一環境條件，啟動批量自動測試。
3. 探針清洗流程
單個樣品測試完成后，探針依次用超純水沖洗3次、無水乙醇沖洗、高純氮氣吹干。益生菌發酵液中的蛋白、脂肽、多糖極易吸附在探針表面，必須徹底清洗，避免交叉污染。全部樣品測試結束后，用無水乙醇短暫浸泡探針，再次沖洗吹干后保存。
4. 測試順序
嚴格按照基線校準、空白測試、樣品測試的順序操作。先檢測超純水基線，確認儀器狀態正常，再測試同批次空白培養基，最后檢測各組益生菌發酵上清樣品。所有測試完成后復測超純水，若純水張力偏差大于0.2mN/m，說明探針存在殘留污染，本組數據作廢，深度清洗探針后重新實驗。
五、數據處理、AUC張力面積計算與益生潛力關聯分析
1. 整理儀器導出的原始動態張力數據，對比實驗前后超純水基線數值，基線漂移超0.2mN/m的樣本數據全部剔除。
2. 以同批次空白培養基張力曲線為基準，扣除基質本底干擾，得到校正后益生菌發酵液動態表面張力-時間變化曲線，保證數據僅反映菌株代謝活性物質的界面作用。
3. 采用梯形積分法對完整時間段的校正曲線進行積分計算，得到AUC張力面積，單位為mN·m?1·min。AUC數值越小，代表菌株代謝產物界面活性越強，界面吸附效率越高、張力下降效果越顯著。同步提取初始表面張力、平衡表面張力、張力下降速率參數，計算所有平行樣本的平均值與標準偏差。
4. 采用同一批次發酵樣品開展體外益生潛力檢測，可檢測指標包含細胞黏附率、病原菌抑菌活性、溶液乳化指數、菌體自聚集與共聚集能力等，量化各組菌株的益生功能水平。
5. 將各組菌株的AUC張力面積與益生潛力指標一一匹配，繪制相關性散點圖，開展統計學相關性分析。結合菌株代謝特性，區分界面活性物質與有機酸等組分對益生功能的貢獻，明確AUC張力面積評價益生菌益生潛力的適配規律。
六、關鍵細節與質量控制
1. AUC張力面積為全周期積分參數，必須保證測試時長完整、曲線達到平衡狀態，禁止截取局部時間段計算積分，無法真實反映菌株整體界面活性。不可用單一平衡張力數值替代AUC參數。
2. 界面張力測試與益生功能檢測必須使用同一批次樣品，縮短兩項實驗的時間間隔，避免活性物質降解導致理化數據與功能數據不匹配。
3. 濾膜必須提前用發酵培養基潤洗，有效降低濾膜對益生菌活性代謝產物的吸附損耗，保證測試數據真實準確。
4. 全程嚴控氣泡產生，微量體系氣泡隱蔽性強，若曲線出現無規則高頻抖動，判定為氣泡干擾，需重新制備樣品測試。
5. 實驗環境溫度波動控制在±1℃以內，實驗臺面保持絕對平穩，避免震動干擾液面狀態，降低曲線噪音，保障AUC積分計算精度。
6. 嚴格控制測試時長不超過120分鐘，實驗環境濕度維持40%至60%，減少溶劑揮發造成的樣品濃度漂移，避免數據失真。
