一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
1. 建立Kibron儀器對(duì)微量植物根系浸出液直接檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，避免濃縮步驟造成根際活性組分變性、損失。
2. 測(cè)定不同處理?xiàng)l件下植物根際分泌物動(dòng)態(tài)表面張力，獲取初始張力、吸附速率、平衡表面張力等參數(shù)，評(píng)價(jià)根際分泌物界面活性。
3. 通過(guò)嚴(yán)格基質(zhì)空白校正，扣除浸提溶劑、培養(yǎng)介質(zhì)帶來(lái)的本底干擾，區(qū)分溶劑效應(yīng)與根系分泌產(chǎn)物的真實(shí)界面作用。
4. 實(shí)現(xiàn)小體積浸出液樣品的可重復(fù)測(cè)試，適用于幼苗、小型植株根際分泌物的界面性質(zhì)評(píng)價(jià)。
二、儀器材料與試劑準(zhǔn)備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀，優(yōu)先選用EZ?Pi Plus單通道或者Delta?8高通量機(jī)型，配備DyneProbe鉑銥探針，溫控樣品臺(tái)，配套Kibron數(shù)據(jù)分析軟件。高速冷凍離心機(jī)，真空脫氣裝置，pH計(jì)，超純水機(jī)。Delta?8更適配微量體積樣品，單通道需選用PTFE微量樣品杯，貨號(hào)3640。
2. 試劑與樣品
待測(cè)植物根系浸出液，根際浸提溶劑（超純水或者弱鹽溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定）。同步制備無(wú)植株處理的浸提溶劑空白，以及基質(zhì)空白，經(jīng)過(guò)與樣品完全一致浸提、孵育、離心過(guò)濾流程。全部溶劑提前真空脫氣10?15min。
3. 耗材
低吸附離心管，Kibron PTFE微量樣品杯或者DynePlate 96孔微孔板，無(wú)水乙醇，0.22μm低吸附水系濾膜，低吸附移液槍頭。濾膜使用浸提溶劑提前潤(rùn)洗，減少分泌物中表活類物質(zhì)被濾膜吸附。
4. 儀器校驗(yàn)準(zhǔn)備
儀器放置于無(wú)震動(dòng)、無(wú)空調(diào)直吹氣流的臺(tái)面，整機(jī)通電預(yù)熱60min，關(guān)閉防風(fēng)罩。鉑銥探針依次超純水沖洗，無(wú)水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞?5℃超純水開展張力校準(zhǔn)，純水表面張力穩(wěn)定72.0?72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，基線穩(wěn)定無(wú)漂移。測(cè)試溫度固定設(shè)置25.0±0.5℃。
微量樣品測(cè)試前確認(rèn)探針無(wú)變形，探針尖端彎折會(huì)造成微量液面接觸異常，直接導(dǎo)致數(shù)據(jù)失效。
三、根系浸出液樣品制備
1. 根際分泌物浸出操作。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成植株培養(yǎng)，采用浸提法收集根系浸出液，控制浸提體積，獲得小體積浸出樣品。設(shè)置空白對(duì)照組，不放置植物植株，其余浸提條件、溶劑、時(shí)間、溫度完全一致，用于扣除溶劑、培養(yǎng)基質(zhì)溶出物帶來(lái)的背景。
2. 樣品預(yù)處理。收集得到的根系浸出液，4000g冷凍離心15min，去除根系碎屑、土壤顆粒、微生物菌體。小心吸取上層清液。上清液使用預(yù)先潤(rùn)洗的0.22μm低吸附濾膜過(guò)濾，除去微小顆粒。全程禁止劇烈震蕩，防止產(chǎn)生氣泡，同時(shí)避免剪切造成部分活性組分結(jié)構(gòu)改變。
3. 樣品分組。分為根系浸出液待測(cè)樣品，浸提溶劑空白，基質(zhì)浸出空白。每個(gè)植株處理設(shè)置3份生物學(xué)平行。樣品體積滿足單通道150?200μL，高通量模式每孔50μL。樣品現(xiàn)制現(xiàn)測(cè)，根際分泌物中部分活性物質(zhì)穩(wěn)定性差，不宜長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，如需短時(shí)間保存，4℃避光存放不超過(guò)12h，上機(jī)前恢復(fù)至室溫。
4. 樣品平衡。過(guò)濾后的樣品以及空白，室溫靜置平衡30min，目視檢查無(wú)沉淀、無(wú)氣泡，出現(xiàn)氣泡需要重新制樣。
四、Kibron微量樣品上機(jī)完整操作流程
1. 軟件參數(shù)設(shè)置。新建動(dòng)態(tài)表面張力時(shí)間掃描程序，測(cè)試溫度25℃。根際分泌物活性物質(zhì)濃度通常偏低，界面吸附慢，總采集時(shí)長(zhǎng)設(shè)置120?180min。采集間隔2?5秒每數(shù)據(jù)點(diǎn)，探針下降速度2mm/min，探針浸入液面深度控制0.3mm。每個(gè)樣品設(shè)置2次技術(shù)重復(fù)。
2. 單通道PTFE微量樣品杯上樣。沿杯壁緩慢加入150?200μL根系浸出液，液體量不可過(guò)少，液面高度不足會(huì)造成溫控偏差以及探針接觸異常。加樣動(dòng)作輕柔，避免沖擊液面產(chǎn)生氣泡。將樣品杯放置溫控樣品臺(tái)，關(guān)閉防風(fēng)罩，靜置8?10min，消除移液擾動(dòng)，等待液面完全穩(wěn)定。探針下降接觸氣液界面，啟動(dòng)采集，記錄完整動(dòng)態(tài)張力?時(shí)間曲線。
如果使用Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL樣品，加樣過(guò)程避免觸碰孔壁液面，加樣完成檢查孔內(nèi)無(wú)氣泡，將微孔板卡緊固定，待測(cè)樣品與兩類空白排布在同一塊微孔板，保證溫度環(huán)境條件一致，啟動(dòng)批量自動(dòng)測(cè)試。
3. 探針清洗流程。每完成一個(gè)微量樣品測(cè)試，探針超純水沖洗3次，無(wú)水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞８H分泌物含有有機(jī)酸、多糖、類表面活性物質(zhì)，極易吸附在探針金屬表面，清洗不充分會(huì)帶來(lái)交叉污染，造成后續(xù)樣品基線偏移。全部樣品測(cè)試結(jié)束后，探針乙醇短暫浸泡，再?zèng)_洗吹干保存。
4. 測(cè)試順序。先測(cè)定超純水基線空白，確認(rèn)儀器狀態(tài)正常，之后測(cè)定基質(zhì)浸出空白、浸提溶劑空白，最后測(cè)定各組根系浸出液樣品。全部測(cè)試結(jié)束復(fù)測(cè)超純水，確認(rèn)探針沒(méi)有吸附殘留。復(fù)測(cè)純水張力偏差大于0.2mN/m，代表探針存在吸附污染，本組數(shù)據(jù)作廢，探針深度清洗后重新實(shí)驗(yàn)。
五、數(shù)據(jù)處理與空白校正步驟
1. 導(dǎo)出全部原始動(dòng)態(tài)張力數(shù)據(jù)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)前后兩次超純水基線，判斷探針是否存在污染殘留。基線漂移超過(guò)0.2mN/m，數(shù)據(jù)不可采信。
2. 區(qū)分兩級(jí)空白，浸提溶劑空白反映溶劑本身的張力；基質(zhì)浸出空白反映培養(yǎng)基質(zhì)溶出物質(zhì)帶來(lái)的界面效應(yīng)。優(yōu)先選用基質(zhì)浸出空白作為主要扣除空白，不可以直接使用純水進(jìn)行數(shù)據(jù)扣除。
3. 將根系浸出液原始張力曲線扣除同批次基質(zhì)浸出空白曲線，得到校正后的動(dòng)態(tài)表面張力曲線。校正后得到的張力下降，才是植物根系分泌產(chǎn)物產(chǎn)生的真實(shí)界面響應(yīng)。
4. 提取校正后關(guān)鍵參數(shù)，初始表面張力，平衡表面張力，張力下降速率。分別計(jì)算生物學(xué)平行和技術(shù)平行的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差。
5. 對(duì)比不同植株處理組校正后的張力變化，評(píng)價(jià)根際分泌物界面活性高低。同步記錄樣品pH，作為輔助參考信息。
六、關(guān)鍵細(xì)節(jié)與質(zhì)量控制
1. 本方案為浸出液直接檢測(cè)，不進(jìn)行濃縮。禁止離心濃縮、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等處理，濃縮會(huì)造成多糖、有機(jī)酸等組分變性或者損失，改變真實(shí)界面行為。樣品濃度極低時(shí)，張力變化幅度小，需要足夠長(zhǎng)采集時(shí)間等待界面吸附達(dá)到平衡。
2. 微量樣品對(duì)揮發(fā)敏感，長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試會(huì)發(fā)生溶劑揮發(fā)，造成樣品組分濃度虛高。采集時(shí)間盡量不超過(guò)180min，環(huán)境濕度盡量維持40?60%，降低揮發(fā)帶來(lái)的干擾。
3. 濾膜必須使用浸提溶劑提前潤(rùn)洗，根際微量活性物質(zhì)很容易被濾膜吸附，造成測(cè)得的張力變化被低估。
4. 全程嚴(yán)防氣泡，微量體系中氣泡很難肉眼分辨，如果曲線出現(xiàn)無(wú)規(guī)則高頻抖動(dòng)，優(yōu)先判定存在氣泡干擾，需要重新制備樣品。
5. 環(huán)境溫度波動(dòng)控制在±1℃以內(nèi)，溫度變化會(huì)直接改變表面張力讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面避免震動(dòng)，震動(dòng)會(huì)干擾微量液面，造成曲線噪音增大。
6. 根際浸出液容易滋生微生物，樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)微生物增殖會(huì)改變組分，樣品必須現(xiàn)制備現(xiàn)檢測(cè)。
