一、實驗目的

1. 使用Kibron表面張力儀測定不同配方基因遞送脂質納米粒的臨界膠束濃度CMC。

2. 完成對應批次脂質納米粒的細胞轉染實驗，定量檢測轉染效率。

3. 分析CMC大小與轉染效率之間的相關性，探究界面膠束形成行為對基因遞送效果的影響，篩選界面性質適配的脂質納米粒處方。

4. 建立一套可重復的界面參數?細胞功能關聯評價實驗流程。

二、儀器、材料與試劑準備

1. 儀器

芬蘭Kibron表面張力儀，可選EZ?Pi Plus或者Delta?8高通量型號，配備鉑銥金屬探針，溫控樣品臺，配套Kibron分析軟件。超純水機，0.22μm水系有機系濾器，高速離心機，渦旋儀，細胞培養箱，熒光酶標儀或者流式細胞儀，pH計。

2. 試劑與樣品

多組不同處方基因遞送脂質納米粒LNP儲備液，包含不同可電離脂質比例、輔助脂質比例的配方，LNP包裹核酸（mRNA/siRNA）。LNP稀釋介質，一般為無血清培養基或者PBS緩沖液，根據體內外應用場景確定。細胞培養用培養基，胎牛血清，轉染用細胞，核酸表達檢測相關試劑。全部緩沖液提前真空脫氣10?15min，0.22μm過濾除去雜質和微氣泡。

3. 耗材

低吸附離心管，石英樣品杯或者Kibron專用96孔微孔板，無水乙醇，移液槍低吸附槍頭。

4. 儀器校驗準備

儀器放置于無震動、避開直吹氣流的實驗臺面，整機通電預熱60min，全程關閉防風罩。鉑銥探針依次超純水沖洗，無水乙醇沖洗，高純氮氣吹干。使用25℃超純水做張力校準，純水表面張力穩定72.0?72.8mN/m，通道之間偏差小于0.2mN/m，確認基線穩定后，方可開展樣品測試。測試溫度固定25.0±0.5℃。

三、脂質納米粒樣品梯度稀釋制備

1. 確定濃度梯度范圍。根據預實驗結果設置足夠寬濃度區間，覆蓋遠低于CMC到遠高于CMC區間，設置12?16個濃度梯度點。高濃度端從LNP母液開始，逐級2倍梯度稀釋。梯度稀釋介質必須和后續測試介質完全統一。

2. 稀釋操作全部使用低吸附離心管，移液操作輕柔，避免劇烈渦旋產生氣泡。每一個稀釋點充分顛倒混勻，禁止高速震蕩。配好的梯度樣品室溫靜置平衡30min，讓脂質膠束充分完成界面平衡。

3. 每個濃度梯度設置2份平行樣品。同步準備空白稀釋介質對照組，用于后續基線扣除。所有樣品目視檢查，無可見沉淀、無氣泡，出現氣泡的樣品需要重新配制。

四、Kibron動態表面張力測定CMC操作流程

1. 軟件參數設置。新建靜態/動態表面張力測試程序，選擇時間掃描模式，測試溫度25℃。每個濃度樣品采集時間設置30?60min，保證表面張力達到平衡。采集間隔2?5秒每點，探針浸入深度控制0.3mm，探針下降速度2mm/min。

2. 單通道石英杯上樣。取150?200μL樣品，沿著杯壁緩慢加入石英樣品杯，避免沖擊液面產生氣泡。將樣品杯放置溫控臺，關閉防風罩靜置5min，消除上樣擾動。控制探針下降接觸氣液界面，啟動采集，等待張力數值完全穩定，記錄平衡表面張力。

如果使用Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL梯度樣品，小心避免產生氣泡，微孔板放置靜置30min，檢查孔內氣泡，有氣泡孔舍棄，將微孔板固定卡槽，啟動批量自動測試。

3. 樣品間探針清洗流程。每完成一個濃度點測試，探針超純水沖洗3次，無水乙醇沖洗，氮氣吹干，再進行下一樣品，防止脂質吸附殘留造成交叉污染。

4. 所有梯度濃度全部完成測試，同步完成空白介質測試，導出全部平衡表面張力原始數據。

五、細胞水平轉染效率測定

1. 使用同一批次，同一稀釋介質的LNP樣品，進行細胞轉染實驗。細胞提前鋪板，細胞匯合度控制在合適范圍，按照實驗方案設置復孔，每個LNP配方設置3個生物學復孔。

2. LNP按照實驗設定的給藥濃度加到細胞孔板，按照標準細胞轉染流程孵育培養。孵育結束后，按照檢測方案處理細胞。

3. 轉染效率檢測，若是熒光報告基因，使用流式細胞儀統計陽性細胞比例，或者酶標儀檢測熒光強度；非熒光核酸可以采用qPCR、蛋白免疫印跡等手段定量核酸表達水平。記錄每個配方的轉染效率數值，同時記錄細胞毒性數據作為輔助參考。

六、數據處理與CMC?轉染效率關聯分析

1. 將Kibron導出的原始數據，扣除空白介質基線，提取每個LNP濃度對應的平衡表面張力。以脂質總濃度為X軸，平衡表面張力為Y軸繪制曲線。

2. 曲線會出現兩段折線，高濃度區間表面張力不再明顯下降，兩段直線交點對應的濃度即為CMC臨界膠束濃度。每個配方平行樣計算CMC平均值以及偏差。

3. 將各個LNP配方得到的CMC數值，與對應批次測得的細胞轉染效率數據進行匹配。繪制CMC?轉染效率散點圖，進行相關性分析。

4. 結果判斷邏輯。CMC數值高低代表脂質形成膠束的能力。CMC偏低代表脂質更容易形成膠束；CMC過高，脂質不容易形成膠束，游離脂質占比高，可能帶來細胞毒性，影響轉染。對比不同處方，判斷是低CMC對應更高轉染效率，還是存在最優CMC窗口。

5. 同步記錄LNP理化表征，粒徑、Zeta電位、包封率，輔助解釋CMC與轉染效率之間的變化關系，區分是CMC本身帶來的效應還是粒徑包封率干擾。

七、關鍵細節與質量控制

1. 梯度稀釋介質必須統一，pH、離子強度嚴格保持一致，緩沖體系變化會直接改變CMC測定結果。

2. 脂質極易吸附在金屬探針表面，探針清洗步驟不可省略，高濃度LNP測試結束后，必要時乙醇浸泡探針去除脂質殘留。

3. 氣泡會嚴重干擾表面張力讀數，配樣、上樣全程嚴防氣泡，出現氣泡必須重新制備樣品。

4. CMC測試和細胞轉染必須使用同一批次LNP，間隔時間盡量縮短，避免LNP儲存降解、粒徑變化，造成兩組數據不匹配。

5. LNP樣品避免強光長時間照射，防止脂質氧化降解。

6. 環境溫度波動控制±1℃以內，溫度會改變CMC與表面張力結果。