一、實驗目的
1. 獲取蛋白藥物4℃儲存前后完整動態表面張力?時間曲線，對比曲線形態、吸附速率、平衡表面張力變化。
2. 通過張力曲線變化評價4℃低溫儲存是否引發蛋白構象改變、界面聚集風險，為制劑低溫穩定性提供界面表征數據。
3. 建立標準化可復現的Kibron儀器蛋白藥物低溫脅迫張力測試方法。
二、實驗材料與儀器準備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀（EZ?Pi Plus/Epsilon/Delta?8），配套原裝桿狀鉑銥探針、溫控樣品臺/96孔測試板，電腦及Kibron采集分析軟件；高速離心機，0.22μm低蛋白吸附濾器，4℃冷藏冰箱，超純水機，pH計，蛋白濃度測定設備。
2. 試劑與樣品
待測蛋白藥物原液（單抗/重組蛋白等），制劑緩沖液（與藥物處方一致），超純水。所有緩沖液經0.22μm過濾，真空脫氣10?15min，去除溶解氣泡，室溫備用。
3. 耗材
低吸附離心管、寬口移液槍頭，石英樣品杯或者96孔測試板，無水乙醇。
4. 儀器前期校驗
儀器放置無明顯震動位置，避開空調直吹氣流，整機通電預熱60min。探針依次超純水沖洗、無水乙醇沖洗，氮氣吹干。使用超純水做張力校準，25℃下純水表面張力穩定在72.0?72.8mN/m，確認傳感器基線正常，通道之間差值小于0.2mN/m，方可開展實驗。測試全程開啟防風罩。
三、樣品分組與4℃儲存處理流程
1. 樣品前處理
蛋白藥物原液使用對應制劑緩沖液稀釋至目標工作濃度，輕柔顛倒混勻，禁止劇烈渦旋，避免剪切誘導蛋白預聚集。10000g室溫離心10min，吸取上層澄清80%樣品，避開底部潛在沉淀，再經0.22μm低蛋白吸附濾器過濾，去除已有聚集體。測定蛋白濃度，保證各組濃度完全一致。同時準備空白緩沖液對照組，同樣過濾脫氣處理。
2. 樣品分裝
將處理后的蛋白藥物樣品等量分裝至若干低吸附離心管，每管體積200?500μL，減少反復開蓋帶來的揮發與污染。分為兩大組：零時刻對照組（儲存前，即刻上機測試）；4℃儲存實驗組，設置多個儲存時間點，例如7d、14d、30d，每個時間點設置3份生物學平行。空白緩沖液同樣分裝，同步4℃儲存。
3. 4℃儲存條件
將實驗組樣品密封避光放入4℃冰箱，冰箱溫度穩定，避免溫度大幅波動。禁止樣品結冰。每個時間點取出對應份數樣品，取出后冰上短暫放置，輕柔顛倒3?5次混勻，不渦旋，離心10000g 10min，取上清，檢查目視無渾濁、沉淀，若出現明顯渾濁該樣品作廢。空白緩沖液同步取出做對照。
4. 儲存后樣品回溫平衡
取出的待測樣品放置到測試溫度環境平衡30min，消除低溫帶來的溫度差，避免上機時溫度漂移干擾張力讀數。
四、Kibron上機測量操作流程
1. 測試參數設定
軟件新建動態張力測試方案，選擇時間掃描模式。測試溫度統一設置25.0±0.5℃。動態采集總時長設置120?180min；蛋白吸附慢的樣品延長至240min。采集頻率設置每2?5秒一個數據點。探針下降速度2mm/min，探針僅微接觸液面，浸入深度0.3mm。每個樣品設置3次技術重復。
2. 上樣操作（單通道微量杯模式）
取潔凈石英樣品杯，沿杯壁緩慢加入150?200μL待測樣品，動作平緩，嚴禁沖擊液面產生微小氣泡，肉眼觀察液面無氣泡方可繼續，有氣泡重新制樣。將樣品杯平穩卡入溫控樣品臺，關閉防風罩，靜置5min，消除移液擾動，等待液面穩定。
若是Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL樣品，按排布放入待測樣品、儲存不同時間點樣品、空白緩沖液，加樣結束輕輕封板膜避光靜置30min，揭膜逐孔檢查氣泡，存在氣泡孔作廢，將微孔板卡緊在儀器載板卡槽，確認無晃動。
3. 啟動采集
單通道模式，控制探針下降至剛好接觸氣液界面，點擊開始采集，軟件自動連續記錄表面張力?時間原始曲線。高通量模式設置掃描順序，啟動批量運行。全部過程不得打開防風罩，防止氣流擾動液面。
每完成一個樣品測試，探針使用超純水沖洗3次，無水乙醇沖洗，氮氣吹干，再進行下一個樣品測試，防止蛋白在探針表面累積污染，造成基線漂移。
4. 空白同步測試
每個儲存時間點對應的4℃儲存空白緩沖液，與蛋白樣品完全相同條件上機，得到緩沖液動態張力曲線，后續用于數據基線扣除。
五、數據處理與指標分析
1. 原始數據導出，扣除對應空白緩沖液的張力基線。
2. 提取關鍵曲線參數：初始表面張力，張力下降速率（蛋白吸附速率），達到平衡后的平衡表面張力，曲線后期是否出現抬升、震蕩、漂移。
3. 對比儲存前（零時刻）與4℃儲存不同時間點曲線變化。4℃儲存后如果蛋白發生構象改變、聚集，通常表現為張力下降速度變快或者變慢，平衡表面張力發生偏移，曲線后期出現抖動、持續漂移。
4. 統計3次生物學平行、3次技術重復，計算平均值和標準偏差。將不同儲存時間的曲線疊加繪圖，同時記錄目視觀察結果（是否渾濁、沉淀）。
5. 可配套輔助檢測，如SEC?HPLC檢測單體、聚集體含量，輔助解釋張力曲線變化，建立界面行為與體相聚集的關聯。
六、關鍵細節與質量控制
1. 全程避免產生氣泡，微小氣泡會造成曲線噪音與漂移；蛋白樣品嚴禁劇烈震蕩渦旋，防止人為引入蛋白聚集。
2. 探針清潔非常關鍵，蛋白容易吸附在金屬探針表面，每次樣品之間必須充分沖洗吹干；長時間測試建議間隔用乙醇徹底清潔探針。
3. 保證所有樣品蛋白濃度、緩沖液pH、離子強度完全一致，只有儲存時間變量，避免其他因素干擾張力結果。
4. 4℃儲存期間樣品管密封，防止水分揮發，揮發會改變蛋白和緩沖鹽濃度，直接造成張力虛假變化。
5. 若樣品出現肉眼可見沉淀，該組數據不可采信，需要重新實驗。
6. 實驗環境溫度波動盡量小于±1℃，溫度變化會直接改變表面張力數值。
