一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
本方案培養(yǎng)嗜熱功能微生物，依托搭載高溫溫控模塊的芬蘭Kibron?Epsilon動(dòng)態(tài)界面張力儀、Delta?8高通量張力檢測(cè)設(shè)備，在菌株適宜的高溫條件下測(cè)定發(fā)酵上清氣?液表面張力、油水界面張力。規(guī)避常溫檢測(cè)造成嗜熱胞外活性物質(zhì)膠束結(jié)構(gòu)改變、活性失活等問(wèn)題，得到真實(shí)高溫環(huán)境下胞外聚合物、生物表面活性劑的界面活性，解析溫度對(duì)于嗜熱菌株代謝產(chǎn)物表面特性的影響規(guī)律。
二、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
1.儀器與耗材準(zhǔn)備
核心儀器為帶有高溫恒溫模塊的Kibron?Epsilon動(dòng)態(tài)界面張力儀，用于精細(xì)測(cè)定高溫環(huán)境動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)；Delta?8高通量張力分析儀搭配高溫控溫基座完成大批量平行樣品篩查；配備耐高溫Wilhelmy合金探針、高溫帕爾貼溫控模塊、耐高溫石英微量樣品杯、耐高溫96孔低吸附微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、儀器配套溫控以及張力采集軟件。
輔助設(shè)備包含超凈工作臺(tái)、高溫恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機(jī)、pH計(jì)、0.22 μm耐高溫低吸附水系濾膜、超聲清洗儀、無(wú)菌離心管、耐高溫取樣容器。
實(shí)驗(yàn)耗材為待測(cè)嗜熱發(fā)酵菌株、適配嗜熱菌的高溫液體發(fā)酵培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液、酸堿調(diào)節(jié)劑、18.2 MΩ超純水、無(wú)水乙醇、異丙醇。
儀器預(yù)處理規(guī)范
接通Kibron高溫模塊電源，提前預(yù)熱60 min，將溫控模塊設(shè)定為嗜熱菌株發(fā)酵溫度，常見(jiàn)設(shè)置55?70 ℃，等待溫度數(shù)值穩(wěn)定，溫度波動(dòng)控制在±0.2 ℃以?xún)?nèi)。
耐高溫合金探針每一次樣品檢測(cè)之前使用丁烷火焰灼燒，灼燒去除黏性多糖、脂肽、發(fā)酵殘?jiān)街铮胖糜诟邷鼗项A(yù)熱至檢測(cè)溫度之后再執(zhí)行零點(diǎn)校準(zhǔn)；高溫狀態(tài)下純水平衡表面張力校準(zhǔn)合格，基線(xiàn)連續(xù)30 min波動(dòng)小于0.2 mN/m之后方可正式測(cè)試。
耐高溫樣品杯、微孔板依次異丙醇擦拭、無(wú)水乙醇沖洗、超純水多次潤(rùn)洗之后氮?dú)獯蹈桑蝗淌种覆灰|碰容器內(nèi)壁，油脂雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾高溫條件下的界面。儀器安置于減震臺(tái)面，閉合高溫模塊防風(fēng)防護(hù)罩，減少高溫下發(fā)酵液水分快速蒸發(fā)造成溶質(zhì)濃縮。
2.菌株發(fā)酵培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)組搭建以及發(fā)酵上清預(yù)處理
嗜熱微生物高溫發(fā)酵培養(yǎng)
將活化后的嗜熱菌株轉(zhuǎn)接至滅菌高溫液體培養(yǎng)基，放置高溫?fù)u床，固定轉(zhuǎn)速、發(fā)酵高溫進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)；設(shè)置空白對(duì)照組為沒(méi)有接種菌體、相同高溫培育的空白培養(yǎng)基；所有實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三組生物學(xué)平行搖瓶。
定時(shí)取樣操作，按照實(shí)驗(yàn)需求采集不同發(fā)酵周期的菌液樣品。
發(fā)酵上清預(yù)處理
1.取出高溫菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉降菌體、固體殘?jiān)徛∩蠈映吻灏l(fā)酵上清；
2.上清含有細(xì)小菌體碎屑、懸浮顆粒時(shí)選用耐高溫低吸附水系濾膜緩慢過(guò)濾；溶液清澈通透直接跳過(guò)過(guò)濾工序，防止疏水型高溫生物表面活性劑被濾膜吸附損耗；
3.待測(cè)上清先水浴升溫至儀器檢測(cè)高溫，低速超聲脫氣5?7 min，超聲功率調(diào)低，避免局部過(guò)熱導(dǎo)致胞外活性物質(zhì)變性失活；
4.樣品升溫之后立刻上機(jī)檢測(cè)，高溫胞外聚合物長(zhǎng)時(shí)間靜置容易發(fā)生變性團(tuán)聚，常溫存放時(shí)長(zhǎng)不可超過(guò)4 h；
5.顛倒離心管動(dòng)作輕柔，禁止劇烈搖晃產(chǎn)生大量氣泡。
3.預(yù)實(shí)驗(yàn)基線(xiàn)驗(yàn)證
將空白高溫培養(yǎng)基放入高溫檢測(cè)模塊，恒溫之后開(kāi)展90 min動(dòng)態(tài)張力測(cè)試，確認(rèn)空白培養(yǎng)基在高溫條件之下界面張力穩(wěn)定，培養(yǎng)基組分不會(huì)降低液相表面張力。
取一份發(fā)酵中后期嗜熱菌上清開(kāi)展預(yù)測(cè)試，檢查耐高溫探針潤(rùn)濕效果正常，儀器能夠識(shí)別胞外活性物質(zhì)帶來(lái)的張力下降。
三、標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)檢測(cè)完整操作流程
1.單通道Kibron?Epsilon高溫模塊精細(xì)檢測(cè)流程
1.吸取150 μL已經(jīng)升溫脫氣處理后的發(fā)酵上清，沿著耐高溫石英樣品杯杯壁緩慢加注，液面不能產(chǎn)生氣泡，出現(xiàn)氣泡則作廢重新制備樣品；
2.將樣品杯放置已經(jīng)恒溫完畢的高溫帕爾貼基座，關(guān)閉防風(fēng)防護(hù)罩，高溫條件之下靜置12 min，使液相溫度完全穩(wěn)定、氣?液界面達(dá)到平衡；
3.開(kāi)啟軟件動(dòng)態(tài)表面張力采集程序，采集時(shí)長(zhǎng)設(shè)置90 min，全程維持高溫，記錄完整張力?時(shí)間吸附曲線(xiàn)，讀取吸附飽和狀態(tài)下平衡表面張力；如需測(cè)試乳化性能可加入高溫預(yù)處理原油，測(cè)定高溫油水界面張力；
4.樣品測(cè)試結(jié)束之后升起耐高溫探針，火焰灼燒清理附著的胞外多糖、脂類(lèi)殘留物，倒掉廢液，耐高溫樣品杯清洗晾干之后檢測(cè)下一份樣品。
2.Delta?8高通量平行樣品篩查流程
全部待測(cè)發(fā)酵上清水浴加熱至檢測(cè)溫度之后添加進(jìn)耐高溫96孔微孔板，單孔添加50 μL待測(cè)液；微孔板加蓋，放置高溫恒溫載板恒溫平衡30 min。
啟動(dòng)儀器自動(dòng)序列檢測(cè)程序，每一個(gè)微孔重復(fù)三次檢測(cè)取平均值。
整板檢測(cè)結(jié)束之后高溫灼燒清潔探針陣列；每隔十個(gè)樣品設(shè)置空白培養(yǎng)基對(duì)照孔，實(shí)時(shí)監(jiān)控高溫環(huán)境下基線(xiàn)漂移。
3.平行樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
同一發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)三份平行上清，高溫狀態(tài)測(cè)得平衡界面張力差值大于0.5 mN/m，樣品需要重新升溫、脫氣復(fù)測(cè)；全部樣品檢測(cè)高溫、界面靜置時(shí)長(zhǎng)、探針下落參數(shù)保持統(tǒng)一。
4.實(shí)驗(yàn)收尾和儀器養(yǎng)護(hù)
檢測(cè)結(jié)束之后關(guān)閉高溫溫控模塊，等待基座自然降溫，反復(fù)灼燒探針清除頑固高溫變性胞外聚合物殘?jiān)荒透邷厝萜鳠崴萸逑矗掖疾潦昧栏伞?dǎo)出所有時(shí)序樣品高溫界面張力、動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)，同步記錄發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)、發(fā)酵液pH；探針干燥防塵存放。
四、數(shù)據(jù)處理與嗜熱菌株界面活性結(jié)果解析
1.關(guān)鍵界面參數(shù)提取
提取高溫條件下界面吸附誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)、張力下降速率、高溫氣?液平衡表面張力、高溫油水界面張力；不同發(fā)酵時(shí)段上清配置濃度梯度，測(cè)定高溫環(huán)境下生物表面活性劑臨界膠束濃度CMC。
2.發(fā)酵周期活性變化分析
對(duì)比不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)發(fā)酵液的高溫界面張力，判斷嗜熱菌株胞外活性物質(zhì)開(kāi)始合成、濃度峰值、高溫降解對(duì)應(yīng)的發(fā)酵階段。
對(duì)比常溫、高溫兩套檢測(cè)結(jié)果，分析高溫環(huán)境對(duì)于膠束聚集、分子界面鋪展能力的影響，部分嗜熱表面活性劑只能夠在高溫下展現(xiàn)優(yōu)良界面活性。
3.培養(yǎng)條件優(yōu)化
設(shè)置不同發(fā)酵溫度、pH、碳源實(shí)驗(yàn)組，依托高溫界面張力數(shù)值篩選出適配嗜熱菌株、高產(chǎn)耐熱生物表面活性劑的發(fā)酵參數(shù)。
五、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)控制要點(diǎn)
1.嗜熱菌代謝產(chǎn)物黏性較強(qiáng)、高溫下更容易粘附耐高溫金屬探針，每一次檢測(cè)之后必須灼燒清潔探針；樣品依照發(fā)酵由早到晚順序檢測(cè)，規(guī)避高濃度活性殘留物污染早期樣品。
2.檢測(cè)全程高溫模塊溫度穩(wěn)定，溫度輕微下降便會(huì)造成耐熱活性劑膠束結(jié)構(gòu)改變，帶來(lái)很大檢測(cè)誤差，不可以使用常溫檢測(cè)代表真實(shí)高溫工況。
3.所有菌株搖瓶發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基配方、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)保持一致，保障菌株之間界面活性具備可比性。
4.發(fā)酵上清禁止劇烈震蕩，氣泡會(huì)消耗液相表層兩親大分子，造成高溫動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)失真。
5.上清澄澈透亮就省略過(guò)濾步驟，疏水脂肽、糖脂容易吸附在濾膜，造成測(cè)得界面張力偏高，低估嗜熱菌株活性。
6.高溫環(huán)境水分揮發(fā)速度很快，樣品靜置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，防止溶劑蒸發(fā)引發(fā)活性物質(zhì)濃縮，干擾最終界面張力數(shù)據(jù)。
